分子生物学新理论新技术在职业卫生中的应用
分子生物学在现代医学中的重要性已被认识，它反映了人f]x~生命现象的认识深入到分子水平，它已带动现代医学和生命科学的各个学科及其领域的发展。职业卫生作为预防医学与临床医学相结合的一门学科，主要任务是解决人们在从事职业活动中有关的医学卫生理论和实践问题。一旦将分子生物学的新理论新技术引入职业卫生，必将促进职业卫生的迅速发展，使我们对职业有害因素与机体相互作用的认识提高到分子水平。也可为控制职业有害因素造成的危害提供新的有效手段，所以职业卫生工作者要对分子生物学取得的成就及发展动态予以特别关注和重视。职业卫生与分子生物学的结合点很多。应用分子生物学的理论和技术来发展职业卫生的前景十分宽广，但目前无论在国内和国外仅是起步阶段，存在明显的滞后现象。本文拟简要介绍分子生物学在职业卫生中应用的概况和展望。
1、职业有害因素的作用及其机制的研究
职业有害因素对机体作用的研究以往主要集中于对细胞和器官的功能和形态在表型方面的观察，例如镉、汞等有毒金属可诱导金属硫蛋白(MT)，氯化镉可致超氧化物歧化酶(SOD)活性降低。六价铬具有致癌作用等。根据分子生物学理论，这类研究可追踪至相关基因的表达、mRNA表达和蛋白质的表达，对职业有害因素的作用有了更深入的了解，甚至探讨分子水平的机制。现以镉为例加以说明。
对皮下注射Cda2的大鼠取肾脏作SO D活性和蛋白含量测定及SO D mRNA斑点杂交。发现SO D活性和mRNA杂交斑点显色强度，染毒组均低于对照组。结果表明，镉对大鼠肾的S()D mRNA转录有明显的抑制，导致S0D活性随之下降，染毒机体抗氧化损伤能力降低。SO D基因表达受抑制可能是镉毒作用的重要环节。
以往很多学者认为，镉所致的肾损害是由肝脏中形成的镉。金属硫蛋白复合物(CdMT)引起的。近年来，用删除了MT基因的动物的实验结果表明，镉对肾的损害并不一定依赖于CdMT的形成，无机镉本身能直接造成肾损害，且可损害整个肾脏，包括肾小球损害和肾间质炎症，而CdMT主要引起肾小管细胞坏死。有人曾观察到CdC1，可特异性地抑制胚胎肢芽细胞的增殖。为了探讨其机制，他们应用免疫组化SP法并结合图像分析技术，发现CdC12在体CbxCd,鼠胚胎肢芽细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和c-MYC基因表达有抑制作用。已知PCNA是一种核内蛋白质，它与细胞增殖有关;CMyC基因编码蛋白在细胞核内表达，能与DNA特异性结合，在调节加入复制方面有重要作用。因此，上述研究揭示了CdCh抑制胚胎肢芽细胞增殖的可能机制。
镉影响基因表达的研究，使我们对镉的毒作用机制有了更深入的了解。镉可以诱导许多早期应激反应基因如GJUN，C-F1)S，CMyC，EGR一1，NUR77和抑癌基因P53等的异常表达。这些基因的异常表达与镉引起肺、前列腺和睾丸肿瘤高发有一定关系。镉还可以影响细胞凋亡和增殖的有关基因和蛋白质的表达，如 12，Baz和PCNA。镉引起的炎症伴随着一些细胞因子基因的表达，如IL.1，IL.6，TNF-a'MIP.2和ICAM-1等。镉也可以诱导热应激蛋白(HsPs)和MT的基因表达，产生的相应蛋白可以防止或减轻镉引起的上述基因的异常表达，增加机体对镉毒性的耐受性。
2、职业卫生与环境
基因组学职业卫生的实践中，常可见到在同一职业环境下工作，接触相同强度的有害因素，有些人发病而有些不发病。这种现象揭示有些个体对特定的职业有害因素存在易感性。流行病学分析发现性别、年龄、营养状况、饮食、疾病及同时接触的其它环境因子等因素与易感性有关。易感性的遗传学基础的研究发现，个体对化学物的易感性与其代谢酶基因的多态性有关。随着DNA测序技术的发展，人类群体多态性的研究巳转向在DNA水平上直接研究基因多态性。受检个体只需提供1～2滴血所含的DNA足以分析和了解该个体所携带的变异等位基因是纯合子或是杂合子。
目前。国内开展研究较多的有细胞色素P一450(CYPs)、6.磷酸萄葡糖脱氢酶(G6PD)、a.1 抗胰蛋白酶(AAT)、N.乙酰化转移酶和对氧磷酶的多态性。至1997年底为止，已报道15种人类细跑色素P一450，其中8种已证明存在表型或基因型多态性与外源性物质代谢最为密切的有CYP 1A1，CYP2D6和CYP 2E1基因。CYP 1A1与多环芳烃代谢有关：
cYP 2D6与吸烟诱发肺癌有关，最近我国学者发现CYP 2D6的一种变异体携带者易罹患锰中毒;CYP 2,.S1基因受酒精和饥饿诱导，其表达的酶与亚硝胺、苯乙烯、 烯、氨基甲酸乙酯、乙醇和四氯化碳等的代谢有关。凡是fl二学物代谢后增毒的。则个体酶的活性愈高，该化学物对个 的毒作用愈大;反之。若代谢为解毒过程。则酶活性愈高，毒作用就愈小。利用此原则可以预测诱导CYPs的化学物联合作用的效应，也可以根据相关的cyp基因的多态性和表达能力预测对特定毒物敏感或耐受的个体。N一乙酞化转移酶(N—acetyltransferase)主要在肝中，但其它器官中也存在。乙酰化转移酶对联苯胺、萘胺、4一氨基联苯等致癌性芳香胺乙酰化过程是解毒过程。
故它们在体内的解毒的快慢决定了其致癌作用强弱。乙酰化减慢可增加接触者罹患由芳香胺所致肝癌和膀胱癌的危险度。己知乙酰化转移酶有NAT和NAT2及一个M TP假基因。它们都位于染色体8pteroql1区段。NAT2基因在芳香胺类化学物的代谢中起重要作用。至1997年。已发现NAT2有17种不同的等位基因。hats变异等位基因的检测和鉴定目前大多采用等位基因特异PCR扩增(allele—specific PCR)或PCR扩增加限制性酶切(PCR RFLP)技术。NAT2的表型分为慢性与快型。据南京汉族人群测得NA丁2慢型表型占18.7%，快型表型占81.3%。基因频率分别为0.432 8和0.567 2。国外早己报道，慢型表型为芳香胺类化学物致膀胱癌的易感因素。我国学者发现NAT2慢型表型也是肝癌的易感因素。这表明我国南京和启东肝癌的致癌因素中，可能有含氮的化合物，如亚硝胺和藻类的多肽肝毒索等起重要作用。这为肝癌防治研究提供了新的线索。
环境基因组计划(EGP)的完成，将对与环境有害因素致病有关基因的多态性及其结构了解清楚，并提供这些基因变异体的DNA序列资料。这表明基因型多态性的测试方法也已建立。职业卫生工作者可利用EGP已建立的方法及基因多态性资料，分别研究不同类型的基因多态性在职业病或健康损害中的作用，它们与职工健康受损的易感性和耐受性关系等。一般可以采取两种途径研究上述问题：(1)在职业卫生实践中发现易感患者，然后分别分析易感患者和一般职工相关基因的多态性，根据后者的分布频率，确定某种基因变异与对某毒物的易感性有关。也可根据某职业人群中各个体间基因表达的差别，再分别鉴定他们基因多态性的DNA序列变异情况，最后确定易感的基因变异体。(2)对己知的基因多态性的各种变异体，如N一乙酰化转移酶NAT2基因的17种不同等位基因的携带者，分别检测他们对代谢磺胺二甲基嘧啶或芳香胺化合物的速度，确定这些NAT2基因的不同等位基因在芳香胺化合物致癌过程中的作用，何者为易感变异体，何者为耐受变异体。也可以预计。在不久的将来，流行病学调查可按基因多态性的不同等位基因为分组依据，以观察他们对职业有害因素反应的差异，筛检出与易感性有关的等位基因，为保护这部分易感人群提供依据。这类研究成果可用于职工就业前体检检出不宜从事该工作的易感个体，或安排其合适的工作岗位。减少有关毒物的接触量，使这类高危人群获得更好的保护。
3、职业肿瘤的防治职业肿瘤的研究
在确定人类致癌物中起了重要作用。分子生物学的进展为职业肿瘤发病机制的研彳。高危人群的筛检和监测以及职业肿瘤的预防和治疗提供了理沦基础和有效的手段。
3.1 化学物致癌机制的研究 近20年来研究细胞癌变机制，包括化学物致癌机制，是分子生物学中最活跃和最富有成效的领域。目前已了解癌的发生是多因素、多阶段和多基因参与的长期发展过程，其中癌基因的活动在癌变过程中起着关键的作用。原癌基因是存在于生物细胞中的基本基因族，是一类能编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，它们可以表达生长因子、某些受体、细胞内信息分子和转录调节因子等。
癌基因学说认为原癌基因和相关的基因(如生长因子及受体的基因)或抗癌基因的表达及其调控失常及DNA修复基因突变等，而导致癌变。
多阶段的致癌过程可以受到许多外源性和内源性因素的影响。机体的对外来物质的代谢系统活性、激素水平和免疫功能等对肿瘤发生多阶段的特定环节都有一定影响。此外。
精神因素对致病过程的影响。也日益受到莺视。从细胞和分子水平探讨致癌机制，目前主要流行的学说有;(1)体细胞突变学说;(2)非遗传机制(epigenetic mechanism)学说;(3)癌基因学说。综合分析当今研究成果，可以认为上述3种学说都只阐明了致癌机制的某一个方面，目前倾向于将这些学说结合起来解释肿瘤的发生。在肿瘤的发生中，基因表达的程序、时问、位置和数量是受不同层次的调控机制控制的，最重要的不是个别基因的表达，而是这些表达之问在时问、空问上的联系和配合。目前已知的人癌基因近100个，而且新的还在不断发现。癌基因学说表明原癌基因(protoncogeng)将是致癌因子主要攻击部位，为体细胞突变学说提供了分子水平的科学依据。细胞信号传导系统的研究成果也充实了非遗传机制的学说，最终还是通过对细胞生长和分化调控系统的影响而发生作用。基因改变除突变以外，染色体易位、癌基因扩增(oncogene amplification)和激话，抑癌基因的丢失(1oss of sup—pressor genes)都是重要的遗传事件，不过对各种肿瘤而言，它们发生的机率和时间顺序可以是不同的。
近来肿瘤与细胞凋亡(apoptosis)的研究颇受重视。细胞调亡或称程序性细胞死亡(programmed ceU death)，是调节细胞数目及生命活动的一个积极主动的过程。肿瘤的发生与凋亡细胞数目减少有关，它与细胞增殖加快有同样意义。例如参与信号传导的某些编码蛋白的基因突变，导致本应凋亡的细胞“非法”存活。使这些细胞获得明显的生长优势。许多促癌剂是通过抑制细胞凋亡而起作用的。凋亡抑制剂很可能也是促癌剂。因此，致癌机制的阐明程度，在很大程度上将取决于对细胞正常生长和分化过程了解的深度。细胞凋亡与癌基因和抑癌基因的关系已受到关注并有较多研究。
在一些DNA修复基因隐性或显性遗传缺陷的患者中，观察到易患某些肿瘤，且其潜伏期较正常人为短。研究表明，这类患者存在DNA修复基因突变或遗传性缺陷。当这些参与DNA修复的基因发生突变时，细胞内各种基因包括肿瘤相关基因的突变频率，将大幅度增高，致使这些细胞易于老化和癌变。
目前多数采用实验动物或细胞经化学致癌物处理后，取肿瘤组织或癌变组织及处理过的细胞，检测肿瘤相关基因变异。例如在亚硝胺化合物诱发的肿瘤组织中发现RAS家族原癌基因点突变。我国学者曾发现经甲基苄基亚硝胺处理过的猴和人胚的食管上皮中，存在Rb，P53等多种肿瘤相关基因的变异。
今后估计会有新的肿瘤相关基因的发现。研究化学物致癌机制不仅从个别癌基因激活和抑癌基因失活着手。而且更应从多种癌基因、抑癌基因、DNA修复基因、细胞凋亡基因等突变形成基因突变网络，引起细胞生长周期信号调控网络失衡方面去认识化学物致癌机制。细胞“信息相互交谈”的失控在肿瘤发生中的作用也值得重视。
3.2 职业肿瘤高危人群的筛检和监测3.2.1 职业肿瘤高危人群的筛检职业肿瘤高危人群，指在相同的职业环境下工作的人群中，有些个体具有更易发生职业肿瘤的倾向。从分子水平基因的改变认识个体对化学物易感性，为职业肿瘤高危人群的筛检奠定了基础。这包括化学致癌物代谢酶有关的基因多态性、突变癌基因及抑癌基因的携带者和DNA修复能力低下者。
在环境基因组计划讨论中，我们已提到N一乙酰胺转移酶NAT2基因的多态性，其中表型为慢型者易罹患芳香胺致癌物诱发的磅胱癌和肝癌。有研究表明，CYP 1A1基因表达强者对多环芳烃引起的肺癌易感，因为CYP 1A1是参与多环芳烃代谢活化的酶。有报道称，人外周淋巴细胞的CYP 1A1水平与人群肺癌发病率呈正相关。
在与肿瘤易感性相关的基因中，有成视网膜瘤细胞基因Rb1基因，该基因为抑癌基因。Rb1杂合子基因携带者对肿瘤是易感者，他们携带有一个突变的Rb1基因和另一个正常的Rb1拷贝。当接触致癌因素后Rb1基因发生第二次突变或丢失，则即可发生肿瘤。P53抑癌基因突变的人群也对化学致癌物特别易感。DNA修复功能降低或障碍也是肿瘤易感性的另一基础。这主要通过常染色体隐性遗传病患者易患肿瘤而发现的。
随着分子生物学的发展，从基因水平上认识肿瘤易感性的知识将日益增多，筛检技术和方法愈来愈简便快速，将能满足职业卫生就业前体检的需要。一般值得列入筛检计划的易感性，在人群中易感者检出率不低于5%，其易感性与某种肿瘤高发的联系非常明确：易感人群与正常人群相比，前者罹患肿瘤的相对危险度应大于3;对筛检出的个体可采取预防措施或给予治疗和其他干预措施，可有效地降低其危险度。
3.2.2 职业肿瘤高危人群的监测 职业人群的监测包括环境监测和生物监测。这里我们只讨论生物监测，而且着重应用分子生物学技术的监测。DNA加合物是常用和首选的监测指标，可说明受检者接触致癌物的接触水平和部份反映接触致癌物产生的效应。致癌物与DNA的加合物是化学物致癌过程的启动所必需的条件，但还不是足够的条件，因为有DNA加合物的组织中并不一定有肿瘤形成。不过检出DNA加合物表明有化学物已抵达靶细胞，并与遗传物质起了反应，是内剂量的监测指标。芬兰铸铁工人接触苯并(a)芘，工人中HPRT突变频率与PAH.DNA加合物有高度相关。B(a)P.7，8.二醇。9，10.环氧化物(BPDE)DNA加合物目前已广泛用作研究人接触多环芳烃的生物监测指标。
近10多年来，内源性氧化剂所致的DNA损伤而产生的8.羟基。2.脱氧鸟苷(8.OHdG)受到重视。它是DNA氧化损伤所产生的主要加合物之一，损伤的累积可导致肿瘤、衰老及与衰老有关的疾病发生。国内已成功地建立了高效液相色谱。
电化学检测方法，对117名接触苯、甲苯和二甲苯工人的检测发现，接触者外周血淋巴细胞8-OHdG与空气苯浓度和尿中粘康酸浓度存在良好相关，说明8-OHdG可作为苯职业接触人群DNA氧化损伤的监测指标。
蛋白加合物在一定条件下可满意地反映DNA加合物的情况，由于与血红蛋白形成的加合物在120 d内比较稳定。加合物的平均水平是反映近120 d内平均接触剂量，而且血红蛋白可以大量获得，因此有一定的应用价值，优于血和尿中毒物及其代谢产物的测定，后者只反映十分近期的接触水平。癌基因蛋白作为职业肿瘤高危人群监测指标，国内已开始应用，我们对氯甲醚工人血清中RAS癌基因产物P21蛋白进行了检测，观察到2名工人P21蛋白表达过度。有人对11名焦炉工和l1名沥青工染色体畸变和血清P21蛋白进行检测。发现接触组染色体畸变和血清P21蛋白水平均显着高于对照组。
有2名沥青工人血清P21蛋白阳性。最近我们用免疫一PCR检测橡胶行业121名工人血液中突变型P53蛋白。结果来自硫化、成型、炼胶工段的58人中l1人为阳性，阳性率为18.97%，而仓库、炊事员、化验和科室人员63人中无阳性者发现。血清癌基因蛋白在临床肿瘤发生之前可被检出。表明癌变病理过程已在体内发展，能否采取干预措施。阻断或逆转此过程，对预防职业肿瘤有重要意义。
4、尘肺与分子生物学
尘肺的发生与发展是十分复杂的过程。涉及粉尘的理化特性和机体的反应，后者包括肺泡巨噬细胞的反应、肺泡上皮细胞的反应、免疫反应，最后导致肺部纤维化形成，其中最关键的是上述机体内发生的一系列反应事件造成胶原总量、分布及其生化均发生改变。目前已知至少有13种不同的胶原蛋白，而尘肺中的胶原疤痕主要由I型和Ⅲ型胶原所组成。
在慢性矽肺中，I型和Ⅲ型胶原的基因被激活，并伴有稳态Ⅲ型胶原mRNA增高，随后稳态I型胶原mRNA增高。研究资料表明，铜蓝蛋白和致纤维化因子均可刺激胶原基因的表达;对大鼠实验性矽肺的观察，发现矽肺组织中I、Ⅲ型胶原mRNA的含量比正常肺组织明显增加，汉防已甲素治疗组I、Ⅲ型胶原含量较未治疗组显着减少，这说明矽肺病变组织中胶原纤维的积聚是与石英粉尘引起胶原基因表达增强有关。
慢性矽肺动物实验中观察到胶原发生转译后修饰。修饰表现为胶原链在赖氨酸或羟基赖氨酸残基处通过共价结合发生交联。交联的胶原可能对胶原酶的分解作用较耐受。因此，慢性矽肺中见胶原合成增加，降解减少。因此，虽然矽结节被富有胶原酶和其他蛋白酶的炎症细胞包围，而胶原仍然奇迹般地积聚。
以上是部分利用分子生物学技术研究尘肺的结果，对矽肺发生的机制有了较深刻的'认识。同时也提示I型和Ⅲ型胶原mRNA的表达，可作为鉴定粉尘致纤维程度的观察指标，也可以用来筛选尘肺治疗药物的指标。可以设想。阻断I型和Ⅲ型胶原基因表达的各种因素，都会对尘肺的预防和治疗有一定作用。
5、职业与衰老
当前预防尘肺、急性和慢性职业中毒仍然是我国职业卫生工作的重要任务，但不再是唯一的任务。在一些经济发达地区，职业卫生开展得好的企业，可能而且需要提高职业人群健康的保护水平，将职业有害因素的危害降至最低水平，甚至完全消除它们的危害。其中重要的课题是“职业与衰老”，目的在于揭示有害因素与机体衰老的相互关系，从而以预防衰老为基础，制订职业卫生的预防措施。这是反映职业卫生工作的发展趋势，顺应经济和社会发展的需要。体现增进职业人群身心键康，使他们健康长寿的重要课题。可以预测。应用分子生物学的新理论和新技术将有利于该课题快速有效的进展。
衰老是随年龄的增长，机体各器官功能全面进行性减退的过程。根据不同物种的平均寿命和最高寿限相对稳定。因此有学者认为，衰老过程可能是由生物体基因组内早已安排好的程序所控制，这种程序可能是生物体在进化过程中逐渐形成的。个体的衰老是遗传因素与环境因素相互作用的结果。有学者预言生物体内存在“衰老基因”。9O年代早期。国外有实验室开始从事分离衰老基因的研究，并声称已分离到衰老基因。如果确实如此，衰老基因一旦被证实。对于揭示职业有害因素影响衰老的作用及其机制的研究及提出预防衰老的对策都将大有用处。职业有害因素在促进衰老过程中，可能会使衰老基因结构发生改变，也可使基因转录为mRNA及相应蛋白质表达发生变化。目前国内研究职业有害因素对遗传物质的影响，多数采用染色体畸变、微核、程序外DNA合成和彗星试验，少数采用细胞 )尺丁基因突变和DNA加合物指标，今后应同时开展职业有害因素对衰老相关基因结构和功能影响的研究。衰老基因很可能与细胞生长、增殖、分化和死亡的调控有关。此外，还应注意对细胞核以外非遗传物质。即信号传导系统网络系统影响的研究。
6、职业病的诊断治疗和预防
目前在职业病的诊断、治疗方面分子生物学理论和技术的应用还不多，而在预防方面相对多一些。但这是有待开发的领域。现举实例加以说明。
6.1 职业病诊断 职业病诊断主要依据职业有害因素接触史、临床表现和实验室检查。在确定生物因素的接触史方面分子生物学技术有其优越柱。例如：肺结核是尘肺的常见并发症。早期诊断对患者的治疗和预防结核菌的传播有重要意义。结核菌的培养检出时间长，阳性率低，不能及时为临床提供可靠的诊断依据。PCR技术具有敏感、特异、快速和高效等特点。它可检出1～100fg结核菌DNA。即相当于1～100个结核菌。国内已有结核杆菌PCR诊断试剂盒出售。其扩增产物为结核杆菌基因保守区165 bp的RNA的片段。我国学者报道，取经X线胸片证实无肺结核病的健康人痰标本2l份，进行PCR检测，结果均为阴性。取尘肺患者痰标本9O份作测定，阳性者23例，表明尘肺患者结核杆菌感染率至少达25.6%，阳性率PCR法较传统方法为高。这说明尘肺患者合并结核，而且是开放性结核的比例相当高，应予以足够重视。
6.2 职业病治疗 目前职业病治疗主要采用对症和支持疗法，少数职业中毒采用特效解毒剂。现在已知，任何环境因素都是通过影响基因的结构和功能。影响基因表达及其调控机制发挥其作用的，因此可以设想，如能阻断其作用环节，是职业病治本的措施。例如采取措施阻断矽肺病人胶原基因的过度表达或胶原的交联，使胶原的合成和降解达到平衡。以阻断矽肺的纤维化进程。
6.3 职业病预防 分子生物学技术在职业病预防方面的应用已显示广阔前景。主要有如下几个方面：
(1)毒物作用性质的鉴定：化学物诱变性或(和)致癌物的鉴定可以应用基因芯片、毒物芯片建立在对DNA损伤的直接观察的基础上。并同时可了解受检物所影响的基因及其相应的功能。这就可以加速化学物毒作用的鉴定。
(2)高危人群的筛检和监测：根据基因多态性在职工就业前对易感者进行筛检，安排合适的工作岗位避免接触易感的职业有害因素等。DNA加合物和癌基因蛋白等用于分子流行病学调查，为制订卫生标准提供依据。
(3)基因预防：对因某基因缺失而导致对某些特定工业毒物易感的个体可以采用基因强化办法，即导入一个附加正常基因拷贝，以增加正常基因产物的数量，使之达到恢复正常表型的水平，如6一磷酸葡糖脱羟酶缺乏和n一1.抗胰蛋白酶缺乏等。
如职业有害因素引起的损害是受损细胞显示新基因产物或不适当的表达，则可采取措施控制其表达在适当水平或采用体内“打靶”抑制有关基因表达和对发生的基因突变进行修复。例如动植物蛋白、醇、植物性树胶，化学物如酐类、铂和异氰酸酯类化合物可引起职业性哮喘。IgE中介的变态反应在这类病例中是重要的。变态反应性疾病仅在小部分接触的工人中经不同的致敏期后发生。现已了解特异性IgE生产涉及B细胞受到由T细胞所产生的淋巴因子如白介素。4、白介素一6、白介素一2和白介索一3所刺激。白介素一4基因过度表达可引起变态疾病已有直接证据。主要表达白介素一4的转基因小鼠，先血清IgE浓度增高，后发展了变态炎症性疾病。这类研究所获结果提示抑制某些基因的表达是控制和预防职业性变态疾病的新途径。
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